GABARAP Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-416746-ACT

GABARAP (proteína associada ao recetor GABA do tipo A) é um membro da família ATG8, semelhante à ubiquitina, que regula a autofagia ao promover a maturação do autofagossoma, o recrutamento de carga e a fusão com lisossomas por meio de interações com proteínas que contêm a região de interação com LC3 (LIR). Também contribui para o tráfego intracelular de membranas e para o agrupamento de recetores, ligando o fluxo autofágico ao transporte vesicular e à organização do citoesqueleto. A desregulação de vias associadas ao GABARAP é relevante para desequilíbrios na proteostase, processos neurodegenerativos e adaptação ao stress em células cancerígenas, em que alterações na autofagia podem influenciar a sinalização de sobrevivência e a remodelação metabólica. Como uma proteína de andaime compacta, com múltiplos parceiros de ligação, o GABARAP é frequentemente estudado para dissecar mecanismos de autofagia seletiva e controlo da qualidade de organelos.

GABARAP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GABARAP sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GABARAP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GABARAP em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GABARAP, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GABARAP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GABARAP nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GABARAP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GABARAP em células tumorais com expressão de GABARAP silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.