G6PD Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-420446-ACT

O gene murino **G6pdx** codifica a glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD), a enzima limitante da velocidade do ramo oxidativo da via das pentoses fosfato, que converte glicose-6-fosfato em 6-fosfogluconolactona enquanto gera NADPH. O NADPH sustenta as defesas antioxidantes dependentes de glutationa, a homeostase redox e programas biossintéticos, incluindo a síntese de lipídios e nucleotídeos, influenciando assim a proliferação e as respostas ao estresse celular. A atividade da G6PD se interconecta com o redirecionamento metabólico na ativação imune e com o tamponamento de espécies reativas de oxigênio mitocondriais, ligando-a a vias que regulam inflamação, suscetibilidade à ferroptose e proteostase. Alterações na expressão ou atividade da G6PD são amplamente usadas como modelo para estudar fenótipos relacionados ao estresse oxidativo e vulnerabilidades metabólicas relevantes para defeitos redox semelhantes aos da anemia e para contextos cardiometabólicos e neuroinflamatórios.

G6PD O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de G6pdx sem alterar a sequência de ADN subjacente.

G6PD O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus G6pdx em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição G6pdx, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de G6PD. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus G6pdx nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de G6PD no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via G6PD em células tumorais com expressão de G6pdx silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.