Fnk Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404710-ACT

O PLK3 humano codifica a quinase de serina/treonina Fnk, um membro da família das quinases do tipo polo que participa da sinalização responsiva ao estresse e do controle do ciclo celular. A atividade de PLK3/Fnk tem sido associada à regulação da sinalização de checkpoints, às respostas a danos no DNA e a vias relacionadas à apoptose, integrando sinais de estresse oxidativo e de insultos genotóxicos. Por meio da fosforilação de substratos a jusante, o PLK3 influencia a progressão mitótica e a homeostase celular, o que o torna relevante para estudos de proliferação, estabilidade genômica e adaptação ao estresse. Alterações na expressão ou na sinalização de PLK3 foram relatadas em múltiplos contextos de doença, incluindo a desregulação, associada ao câncer, de redes de ciclo celular e de resposta a danos.

Fnk O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PLK3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Fnk O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PLK3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PLK3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Fnk. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PLK3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Fnk no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Fnk em células tumorais com expressão de PLK3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.