FN3K Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-412985-ACT

O FN3K humano codifica a frutossamina-3-quinase, uma enzima citosólica que fosforila frutossilisina e cetoaminas relacionadas em proteínas glicadas, promovendo sua desestabilização e a subsequente desglicação. Ao limitar o acúmulo de produtos finais de glicação avançada e a disfunção proteica mediada por glicação, o FN3K contribui para a proteostase e para a homeostase metabólica sensível ao estado redox em contextos de fluxo elevado de glicose. A atividade do FN3K intersecciona o metabolismo de carboidratos e as respostas ao estresse celular ao modular a carga de glicação proteica não enzimática. Alterações na expressão ou na função do FN3K têm sido estudadas em relação à desregulação metabólica e a complicações ligadas à hiperglicemia crônica, bem como a efeitos mais amplos sobre o controle de qualidade proteica.

FN3K O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FN3K sem alterar a sequência de ADN subjacente.

FN3K O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FN3K em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FN3K, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de FN3K. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FN3K nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de FN3K no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via FN3K em células tumorais com expressão de FN3K silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.