FBXO6 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h2): sc-405919-ACT-2

O gene humano FBXO6 codifica uma proteína do tipo F-box que atua como componente de reconhecimento de substratos dos complexos de ligase E3 de ubiquitina SCF (SKP1–CUL1–RBX1), ligando proteínas-alvo à ubiquitinação e à subsequente degradação pelo proteassoma. O FBXO6 é mais bem caracterizado na degradação associada ao retículo endoplasmático (ERAD), na qual reconhece glicoproteínas mal dobradas por meio de interações do tipo lectina e promove sua eliminação, influenciando assim a proteostase, a sinalização de estresse do retículo endoplasmático e o controle de qualidade de proteínas secretórias e de membrana. Por essas funções, o FBXO6 se conecta a vias que controlam o dobramento proteico, a regulação dependente de ubiquitina e as respostas celulares ao estresse, com associações relatadas à biologia do câncer, a fenótipos metabólicos e inflamatórios e a distúrbios ligados à homeostase proteica aberrante. A edição gênica ou a perturbação de FBXO6 permite estudos mecanísticos da especificidade de substratos em ligases SCF, da dinâmica do ERAD e das consequências transcricionais e de sinalização a jusante decorrentes da alteração do controle de qualidade proteica mediado por ubiquitina em modelos de células humanas.

FBXO6 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FBXO6 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

FBXO6 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FBXO6 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FBXO6, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de FBXO6. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FBXO6 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de FBXO6 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via FBXO6 em células tumorais com expressão de FBXO6 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.