FACE-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403350-ACT

O ZMPSTE24 humano codifica a FACE-1, uma metaloprotease de zinco inserida na membrana do retículo endoplasmático que catalisa etapas proteolíticas essenciais na maturação da pré-lamina A. Ao clivar o C-terminal farnesilado da pré-lamina A, a FACE-1 favorece a montagem adequada da lâmina nuclear, a morfologia nuclear e a organização da cromatina, ligando sua atividade à estabilidade do genoma e à regulação do ciclo celular. A disrupção do processamento dependente de ZMPSTE24 promove o acúmulo de intermediários tóxicos de pré-lamina A e a alteração da mecanotransdução, conectando essa via a fenótipos de envelhecimento precoce e a estados de estresse celular associados a laminopatias. A função da FACE-1 também é relevante para a proteostase mais ampla de proteínas de membrana do RE e para redes de processamento de proteínas modificadas por lipídios que influenciam a integridade do envelope nuclear.

FACE-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ZMPSTE24 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

FACE-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ZMPSTE24 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ZMPSTE24, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de FACE-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ZMPSTE24 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de FACE-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via FACE-1 em células tumorais com expressão de ZMPSTE24 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.