Exo70 Double Nickaseプラスミド (m): sc-424708-NIC

Exoc7は、分泌小胞を特定の形質膜部位につなぎ留めて極性をもったエキソサイトーシスを可能にする、八量体エキソシスト複合体の中核サブユニットであるExo70をコードしている。マウス細胞では、Exo70は小胞のドッキングをアクチン細胞骨格の再構築および低分子量GTPアーゼのシグナル伝達経路と協調させることで、上皮の極性化、神経突起の伸長、細胞質分裂、方向性をもつ細胞移動に必要な膜輸送イベントを支える。エキソシスト依存的なトラフィッキングは、受容体のリサイクリングや接着分子の細胞表面への輸送に影響し、Exo70の機能を細胞形態、浸潤、組織形態形成を制御する経路と結び付けている。エキソシスト構成要素の機能異常は、異常な細胞運動性や発生異常と関連していることから、Exoc7はトラフィッキング駆動性の表現型を機構的に解析するための有用な標的となる。

Exo70 ダブルニカースプラスミド（m）は、mouse 細胞株における Exoc7 座の高特異性編集のために設計された、対となる2つのプラスミドから構成される。各プラスミドは、Cas9 D10Aニカースと、Exoc7内の対向するDNA鎖を標的とする異なるsgRNAを発現する。対向するDNA鎖上の隣接する部位に誘導されると、2つのニカースはオフセットした一本鎖切断を生成し、これらが組み合わさってずれた二本鎖切断を生じさせる。これにより、両方のガイドによる協調的なオンターゲット活性が必要となる。生じたDNA切断は、細胞内の内在性修復経路、特に非相同末端結合（NHEJ）によって修復され、その結果、Exoc7の機能を阻害する挿入または欠失が生じる。標的座標における2つのsgRNAの結合を必要とするこの二重ニッキング法は、編集の特異性を高め、標的精度に対するさらなる制御が求められる用途において、CRISPR戦略を補完するものである。

編集された細胞を効率的に同定するために、1つのプラスミドはトランスフェクトされた細胞集団を蛍光可視化するためのGFPをコードし、もう1つのプラスミドは抗生物質選別用のプロマイシン耐性遺伝子を保有しています。これらの機能により、共トランスフェクトされた細胞集団の効率的な濃縮が可能となり、Exoc7が破壊されたクローンの検証が簡素化されます。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。