ESD Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404314-ACT

A ESD humana codifica a S-formilglutationa hidrolase/esterase D, uma hidrolase de serina citosólica que catalisa a hidrólise da S-formilglutationa em glutationa e formiato na via de desintoxicação do formaldeído da metabolização de um carbono dependente de glutationa. Ao sustentar a homeostase da glutationa e a depuração de aldeídos reativos, a atividade de ESD influencia o equilíbrio redox celular, as respostas ao estresse proteotóxico e a suscetibilidade a danos no DNA e em proteínas induzidos por aldeídos. A desregulação do processamento de aldeídos e do tamponamento por glutationa está implicada em fenótipos ligados ao estresse oxidativo e em vulnerabilidades metabólicas observadas em múltiplos contextos de doença, incluindo câncer e estados inflamatórios. Assim, a ESD é um nó útil para estudar o metabolismo de aldeídos, a sinalização redox e a adaptação ao estresse em células humanas.

ESD O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ESD sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ESD O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ESD em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ESD, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ESD. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ESD nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ESD no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ESD em células tumorais com expressão de ESD silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.