Plasmide CRISPR d'Activation (h) ESD: sc-404314-ACT

L’ESD humain code l’hydrolase de S-formylglutathion/estérase D, une hydrolase à sérine cytosolique qui catalyse l’hydrolyse du S-formylglutathion en glutathion et formiate dans la branche de détoxification du formaldéhyde du métabolisme des unités monocarbonées dépendant du glutathion. En soutenant l’homéostasie du glutathion et l’élimination des aldéhydes réactifs, l’activité d’ESD influence l’équilibre rédox cellulaire, les réponses au stress protéotoxique et la susceptibilité aux dommages de l’ADN et des protéines induits par les aldéhydes. Une prise en charge dérégulée des aldéhydes et une capacité tampon du glutathion altérée sont impliquées dans des phénotypes liés au stress oxydant et des vulnérabilités métaboliques observés dans de multiples contextes pathologiques, notamment le cancer et les états inflammatoires. En conséquence, ESD constitue un nœud pertinent pour étudier le métabolisme des aldéhydes, la signalisation rédox et l’adaptation au stress dans les cellules humaines.

ESD Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ESD sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ESD Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ESD dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ESD, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ESD. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ESD natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ESD au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ESD dans les cellules tumorales présentant une expression de ESD silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.