Erythropoietin/EPO Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400283-ACT

EPO codifica a eritropoietina, uma hormona glicoproteica secretada que regula a sobrevivência, proliferação e diferenciação de progenitores eritroides, principalmente através da ligação ao EPOR e da sinalização a jusante JAK2/STAT5, com contributos adicionais das vias PI3K/AKT e MAPK. A sua expressão é rigidamente controlada por mecanismos de deteção de oxigénio, em particular pela regulação transcricional dependente de HIF, ligando o stress hipóxico à eritropoiese. A desregulação da sinalização EPO/EPOR e programas alterados de resposta ao oxigénio são relevantes para a biologia da anemia, a policitemia e adaptações associadas à hipóxia tumoral, sendo frequentemente estudadas em sistemas modelo hematopoiéticos, renais e de cancro. A EPO é também usada como leitura da atividade da via de hipóxia e como marcador de alterações do estado celular que afetam a secreção endócrina de citocinas.

Erythropoietin/EPO O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EPO sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Erythropoietin/EPO O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EPO em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EPO, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Erythropoietin/EPO. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EPO nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Erythropoietin/EPO no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Erythropoietin/EPO em células tumorais com expressão de EPO silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.