EphA3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401565-ACT

EPHA3 codifica o receptor tirosina-quinase EphA3, um membro da família ephrin–Eph que medeia sinalização dependente de contacto para regular o posicionamento celular, a adesão e a formação de limites tecidulares. Após a ligação a ligandos ephrin-A ancorados à membrana, o EphA3 inicia uma sinalização bidirecional que remodela o citoesqueleto de actina e modula vias que controlam a migração e a orientação celular, incluindo programas dependentes de GTPases da família Rho e sinalização por quinases a jusante. A atividade do EphA3 está implicada em processos de desenvolvimento como a orientação axonal e o padrão vascular, e alterações na expressão ou na sinalização de EPHA3 têm sido associadas à invasão de células tumorais, a interações com o microambiente e à reprogramação de vias oncogénicas em múltiplos contextos de cancro. Estas características tornam o EPHA3 um alvo útil para dissecar redes de comunicação impulsionadas por recetores e a plasticidade fenotípica específica do contexto em células humanas.

EphA3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EPHA3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

EphA3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EPHA3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EPHA3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de EphA3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EPHA3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de EphA3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via EphA3 em células tumorais com expressão de EPHA3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.