EB1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401367-ACT

O MAPRE1 humano codifica a proteína de ligação à extremidade 1 (EB1), um fator central de rastreamento da extremidade plus dos microtúbulos (+TIP) que coordena a dinâmica dos microtúbulos com a captura cortical, a montagem do fuso mitótico e a segregação cromossômica. A EB1 interage com a APC e outras proteínas +TIP para regular o crescimento dos microtúbulos, a polaridade celular e o tráfego intracelular, conectando a remodelação do citoesqueleto ao controle do ciclo celular. A desregulação de MAPRE1/EB1 tem sido associada a alterações na fidelidade mitótica, aneuploidia e comportamento celular invasivo, tornando-a relevante para o estudo de vias subjacentes a fenótipos proliferativos e migratórios. Seu papel central em processos dependentes de microtúbulos também sustenta pesquisas mecanísticas sobre a função do centrossomo e a regulação do checkpoint do fuso.

EB1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MAPRE1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

EB1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MAPRE1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MAPRE1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de EB1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MAPRE1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de EB1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via EB1 em células tumorais com expressão de MAPRE1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.