Dhh Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403357-ACT

O DHH humano codifica o Desert hedgehog (Dhh), um morfógeno secretado da família Hedgehog que regula a especificação do destino celular e a padronização dos tecidos por meio da sinalização canônica PTCH1–SMO e dos fatores de transcrição GLI a jusante. O Dhh é particularmente importante no desenvolvimento dos nervos periféricos e na diferenciação gonadal, coordenando a maturação da linhagem de células de Schwann e a função de células somáticas testiculares. Alterações na expressão de DHH ou na atividade da via têm sido associadas a distúrbios do desenvolvimento sexual e a fenótipos relacionados à neuropatia periférica, e ele é frequentemente estudado como um regulador dependente do contexto de programas de sinalização do desenvolvimento. Como um nó de via acionado por ligante, o Dhh oferece uma ferramenta acessível para dissecar comunicação parácrina, gradientes de morfógenos e respostas transcricionais em sistemas-modelo de células-tronco, organoides e desenvolvimento.

Dhh O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DHH sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Dhh O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DHH em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DHH, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Dhh. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DHH nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Dhh no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Dhh em células tumorais com expressão de DHH silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.