Plasmide CRISPR d'Activation (h) DDB2: sc-401686-ACT

Le gène humain **DDB2** code un facteur de reconnaissance des lésions de l’ADN qui forme, avec **DDB1**, le complexe **UV-DDB**, agissant en amont de la ligase ubiquitine E3 **CUL4A–RBX1** pour initier la réparation par excision de nucléotides du génome global (GG-NER). En se liant aux dimères de pyrimidines cyclobutanes induits par les UV (CPD) et aux photoproduits 6-4, DDB2 favorise la vérification des lésions, le remodelage de la chromatine et le recrutement des composants NER en aval, contribuant ainsi à la stabilité du génome et aux réponses de points de contrôle du cycle cellulaire. L’activité de DDB2 s’inscrit à l’interface de la protéostasie médiée par l’ubiquitine et des voies de réparation de l’ADN couplées à la transcription, influençant la sensibilité cellulaire au stress génotoxique. Une régulation altérée de DDB2 a été associée à une capacité de réparation de l’ADN déficiente et à une accumulation de mutations pertinentes pour la biologie des cancers et les phénotypes liés à la photosensibilité, ce qui en fait une cible utile pour des études mécanistiques de la signalisation des dommages à l’ADN.

DDB2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DDB2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DDB2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DDB2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DDB2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DDB2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DDB2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DDB2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DDB2 dans les cellules tumorales présentant une expression de DDB2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.