DDB2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401686-ACT

O DDB2 humano codifica um fator de reconhecimento de danos no DNA que forma o complexo UV-DDB com o DDB1, atuando a montante da ligase E3 de ubiquitina CUL4A–RBX1 para iniciar o reparo por excisão de nucleotídeos do genoma global (GG-NER). Ao se ligar a dímeros de pirimidina ciclobutano induzidos por UV e a fotoprodutos 6-4, o DDB2 promove a verificação da lesão, a remodelação da cromatina e o recrutamento de componentes de NER a jusante, sustentando assim a estabilidade do genoma e as respostas de checkpoint do ciclo celular. A atividade do DDB2 intersecciona com a proteostase mediada por ubiquitina e com vias de reparo do DNA acopladas à transcrição, influenciando a sensibilidade celular ao estresse genotóxico. Alterações na regulação do DDB2 têm sido associadas a capacidade deficiente de reparo do DNA e ao acúmulo de mutações relevantes para a biologia do câncer e para fenótipos relacionados à fotossensibilidade, tornando-o um alvo útil para estudos mecanísticos de sinalização de dano ao DNA.

DDB2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DDB2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DDB2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DDB2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DDB2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DDB2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DDB2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DDB2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DDB2 em células tumorais com expressão de DDB2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.