DAP12 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400916-ACT

TYROBP codifica a proteína 12 ativadora de DNAX (DAP12), um adaptador transmembranar contendo ITAM que acopla recetores ativadores em células mieloides e linfoides à sinalização a jusante. A DAP12 associa-se a recetores como TREM2, SIRPβ1 e a certos recetores de células NK para promover a fosforilação de SYK/ZAP70 e ativar as vias PI3K, MAPK e NF-κB, que regulam a fagocitose, a produção de citocinas, o burst oxidativo e a sobrevivência celular. Em micróglia e macrófagos, a sinalização dependente de TYROBP molda a ativação da imunidade inata, o metabolismo de lípidos e a remoção de detritos celulares, ligando-a a processos neuroinflamatórios e à desregulação imunitária. Alterações na sinalização TYROBP/DAP12 têm sido associadas a fenótipos inflamatórios e relacionados com neurodegeneração, tornando-a um alvo útil para estudar redes de sinalização recetor–adaptador em células imunitárias humanas.

DAP12 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TYROBP sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DAP12 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TYROBP em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TYROBP, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DAP12. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TYROBP nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DAP12 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DAP12 em células tumorais com expressão de TYROBP silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.