DAP10 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402426-ACT

HCST codifica a proteína 10 de ativação de DNAX (DAP10), um adaptador transmembranar que acopla o NKG2D e recetores relacionados à sinalização intracelular em linfócitos citotóxicos humanos. Por meio do seu motivo YINM, a DAP10 recruta PI3K e Grb2/Vav1 para promover a ativação das vias Akt e MAPK, sustentando a formação da sinapse imunitária, a produção de citocinas e a citotoxicidade mediada por células. Este eixo de sinalização regula a vigilância, por células NK e células T CD8⁺, de células sob stress, infetadas ou transformadas e influencia a comunicação inflamatória no microambiente tumoral. A desregulação da atividade de HCST/DAP10 tem sido implicada em respostas imunitárias inata e adaptativa alteradas, relevantes para a imunobiologia do cancro, a infeção viral e a inflamação autoimune.

DAP10 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HCST sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DAP10 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HCST em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HCST, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DAP10. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HCST nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DAP10 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DAP10 em células tumorais com expressão de HCST silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.