Dab1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402167-ACT

DAB1 codifica o Disabled-1 (Dab1), uma proteína adaptadora citoplasmática que transduz sinais de Reelin para coordenar a migração neuronal, a laminação cortical e o crescimento de neuritos durante o desenvolvimento do cérebro. Após a ligação de Reelin aos recetores VLDLR e LRP8 (ApoER2), Dab1 é fosforilada em resíduos de tirosina e acopla-se a cinases da família Src a jusante e a vias de remodelação do citoesqueleto que moldam o posicionamento celular e a organização sináptica. Este eixo de sinalização cruza-se com a dinâmica da actina, a regulação dos microtúbulos e mecanismos de turnover proteico que influenciam a polaridade neuronal e a conectividade. A atividade desregulada da via DAB1/Reelin está implicada na biologia de doenças do neurodesenvolvimento e neuropsiquiátricas, tornando DAB1 um ponto útil para estudos mecanísticos da formação de circuitos cerebrais e de fenótipos de migração celular.

Dab1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DAB1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Dab1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DAB1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DAB1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Dab1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DAB1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Dab1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Dab1 em células tumorais com expressão de DAB1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.