Cytokeratin 15 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401869-ACT

KRT15 codifica la citocheratina 15, una proteina dei filamenti intermedi di tipo I arricchita nei compartimenti epiteliali basali e frequentemente utilizzata come marcatore di stati progenitori e “stem-like” dei cheratinociti. La citocheratina 15 contribuisce all’integrità del citoscheletro, alla dinamica delle adesioni cellula–cellula e alle risposte allo stress dell’epitelio tramite l’assemblaggio dei filamenti di cheratina e il cross-talk con i programmi di differenziamento e riparazione delle ferite. La sua espressione è associata all’omeostasi e al rimodellamento epiteliale, con correlazioni riportate con stati di differenziamento alterati nella cute e in altri epiteli stratificati. Pattern di KRT15 deregolati sono stati studiati in contesti di iperproliferazione epiteliale, plasticità delle cellule tumorali e biologia del follicolo pilifero, a supporto della sua utilità in studi meccanicistici dell’impegno di linea e della rigenerazione tissutale.

Cytokeratin 15 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KRT15 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Cytokeratin 15 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KRT15 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KRT15, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Cytokeratin 15. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KRT15 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Cytokeratin 15 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Cytokeratin 15 nelle cellule tumorali con espressione di KRT15 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.