Cytokeratin 14 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400362-ACT

KRT14 codifica a citoqueratina 14, uma proteína de filamentos intermediários do tipo I que forma um heterodímero com a queratina 5 para constituir a rede de queratinas basais em epitélios estratificados. Esse arcabouço do citoesqueleto sustenta a resistência mecânica, a adesão célula–célula e a diferenciação epitelial, além de se integrar a nós de sinalização como complexos de integrina/hemidesmossomo e respostas ao estresse reguladas pelo citoesqueleto. Alterações na expressão ou na função de KRT14 estão associadas a fenótipos de fragilidade epidérmica e à queratinização desregulada, e o gene é frequentemente usado como marcador de estados epiteliais do tipo basal na pele e em tecidos glandulares. Em biologia do câncer e em modelos de remodelação tecidual, programas associados a KRT14 são estudados em relação à plasticidade epitelial, a fenótipos ligados à invasão e à adaptação ao estresse do microambiente.

Cytokeratin 14 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de KRT14 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Cytokeratin 14 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus KRT14 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição KRT14, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Cytokeratin 14. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus KRT14 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Cytokeratin 14 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Cytokeratin 14 em células tumorais com expressão de KRT14 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.