cSHMT Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403678-ACT

O SHMT1 humano codifica a serina-hidroximetiltransferase citosólica (cSHMT), uma enzima dependente de fosfato de piridoxal que catalisa de forma reversível a conversão de serina em glicina, ao mesmo tempo que gera 5,10-metilenotetraidrofolato para o metabolismo de um carbono. A cSHMT conecta a biossíntese de nucleotídeos dependente de folato à capacidade de metilação ao fornecer unidades de um carbono para a síntese de timidilato e purinas e ao coordenar o fluxo metabólico sensível ao estado redox. Por meio do seu papel nas vias do folato/um carbono, o SHMT1 influencia a fidelidade da replicação e do reparo do DNA, a regulação epigenética e as respostas celulares à disponibilidade de nutrientes. A desregulação desse eixo é frequentemente investigada em modelos de estresse proliferativo e reprogramação metabólica, com implicações para fenótipos de doença associados à estabilidade genômica.

cSHMT O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SHMT1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

cSHMT O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SHMT1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SHMT1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de cSHMT. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SHMT1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de cSHMT no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via cSHMT em células tumorais com expressão de SHMT1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.