creatine kinase-M Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401132-ACT

O CKM humano codifica a creatina quinase M, uma fosfagênio-quinase citosólica que catalisa a transferência reversível de fosfato entre ATP e creatina para gerar fosfocreatina, atuando assim como um tampão de ATP celular e sustentando uma rápida renovação de energia. O CKM está fortemente associado à bioenergética do músculo estriado e contribui para a homeostase metabólica durante a contração, conectando a demanda energética às vias da glicólise e da fosforilação oxidativa. Alterações na expressão ou na atividade de CKM são frequentemente estudadas em contextos de lesão muscular, miopatias e estresse metabólico, nos quais a dinâmica da fosfocreatina pode refletir mudanças na função mitocondrial e na energética celular. Como marcador de linhagem muscular e do metabolismo energético, o CKM também é usado para investigar o estado de diferenciação, a organização sarcomérica e a remodelação metabólica em sistemas modelo.

creatine kinase-M O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CKM sem alterar a sequência de ADN subjacente.

creatine kinase-M O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CKM em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CKM, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de creatine kinase-M. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CKM nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de creatine kinase-M no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via creatine kinase-M em células tumorais com expressão de CKM silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.