CNT2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-409209-ACT

SLC28A2 kodiert den konzentrierenden Nukleosidtransporter 2 (CNT2), einen hochaffinen, natriumabhängigen Transporter, der die zelluläre Aufnahme von Purin-Nukleosiden wie Adenosin und Inosin über die Plasmamembran vermittelt. Durch die Kontrolle der Nukleosid-Rettungswege (Salvage) und der intrazellulären Nukleotidpools beeinflusst CNT2 den Energiestoffwechsel, die Nukleinsäuresynthese und purinerge Signalwege, die zelluläre Stressreaktionen mitprägen. Die CNT2-Aktivität ist besonders in Geweben mit hohem Nukleosidumsatz relevant, darunter Darm und Niere, und sie spielt zudem in pharmakologischen und toxikologischen Kontexten eine Rolle, in denen der Umgang mit Nukleosidanaloga eine entscheidende Variable ist. Eine fehlregulierte Nukleosidaufnahme wurde mit veränderten metabolischen Zuständen und krankheitsassoziiertem Umbau der Nukleotid-Homöostase in Verbindung gebracht, was SLC28A2 zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Studien transportgetriebener Veränderungen von Signal- und Stoffwechselwegen macht.

CNT2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC28A2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CNT2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC28A2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC28A2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CNT2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC28A2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CNT2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CNT2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC28A2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.