CNT2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-409209-ACT

SLC28A2 codifica o transportador concentrativo de nucleosídeos 2 (CNT2), um transportador de alta afinidade dependente de sódio que medeia a captação celular de nucleosídeos purínicos, como adenosina e inosina, através da membrana plasmática. Ao controlar a via de salvamento de nucleosídeos e os pools intracelulares de nucleotídeos, o CNT2 influencia o metabolismo energético, a síntese de ácidos nucleicos e vias de sinalização purinérgica que moldam as respostas celulares ao estresse. A atividade do CNT2 é particularmente relevante em tecidos com alto fluxo de nucleosídeos, incluindo intestino e rim, e contribui para contextos de farmacologia e toxicologia em que o manuseio de análogos de nucleosídeos é uma variável fundamental. A desregulação do transporte de nucleosídeos tem sido associada a estados metabólicos alterados e à remodelação, relacionada a doenças, da homeostase de nucleotídeos, tornando o SLC28A2 um alvo útil para estudos mecanísticos de alterações de vias impulsionadas pelo transporte.

CNT2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLC28A2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CNT2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLC28A2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLC28A2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CNT2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLC28A2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CNT2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CNT2 em células tumorais com expressão de SLC28A2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.