CKR-5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402548-ACT

CCR5 codifica il recettore umano per chemochine CKR-5, un GPCR a sette domini transmembrana espresso prevalentemente su cellule T, macrofagi e cellule dendritiche, dove lega ligandi quali CCL3, CCL4 e CCL5 per indirizzare la chemiotassi dei leucociti. La segnalazione di CKR-5 coinvolge proteine G eterotrimeriche per attivare vie che includono PI3K/AKT, il flusso di calcio mediato da PLCβ, MAPK/ERK e il rimodellamento del citoscheletro, che coordinano la migrazione cellulare e le risposte infiammatorie. Grazie al suo ruolo nel traffico e nell’attivazione delle cellule immunitarie, CCR5 è ampiamente studiato nell’infiammazione e nella sorveglianza immunitaria dei tessuti, e differenze genetiche o di espressione sono state associate a variazioni nella suscettibilità e nella progressione in molteplici contesti di malattie immuno-mediate e infettive. Nei sistemi sperimentali, l’espressione di CCR5 è spesso utilizzata come indicatore della segnalazione mediata dal recettore, della percezione dei gradienti di chemochine e della modulazione del comportamento delle cellule mieloidi e linfoidi.

CKR-5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CCR5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CKR-5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CCR5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CCR5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CKR-5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CCR5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CKR-5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CKR-5 nelle cellule tumorali con espressione di CCR5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.