Cdt2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-407212-ACT

O DTL humano codifica a Cdt2, um receptor de substrato do complexo ligase E3 de ubiquitina CRL4^Cdt2, que coordena a progressão do ciclo celular com a replicação e o reparo do DNA. A Cdt2 promove a fidelidade da fase S ao direcionar fatores-chave do licenciamento da replicação e do checkpoint, incluindo CDT1, p21 (CDKN1A) e SETD8, para ubiquitinação dependente de PCNA e degradação proteassomal durante a síntese de DNA e após estresse genotóxico. Por meio dessas funções, ela influencia o controle das origens de replicação, a estabilidade do genoma e a sinalização da resposta a danos no DNA. A atividade desregulada de DTL/Cdt2 tem sido associada a fenótipos proliferativos e a controle alterado de checkpoints em contextos relevantes para o câncer, tornando-a um ponto útil para estudar estresse replicativo oncogênico e vulnerabilidades do ciclo celular.

Cdt2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DTL sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Cdt2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DTL em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DTL, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Cdt2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DTL nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Cdt2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Cdt2 em células tumorais com expressão de DTL silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.