CDKN1B/Kip1 p27 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400074-ACT

CDKN1B codifica p27^Kip1, um inibidor de quinases dependentes de ciclina que limita a progressão através do checkpoint G1/S impulsionada por CDK2 e CDK4/6, ao modular os complexos ciclina E/A–CDK2 e ciclina D–CDK4/6. p27 integra sinais mitogénicos e antiproliferativos a jusante de vias como PI3K–AKT e TGF-β, e a sua abundância é rigidamente controlada por ubiquitinação dependente de fosforilação e degradação pelo proteassoma. Por meio destes mecanismos, CDKN1B influencia programas de proliferação, quiescência e diferenciação em diversos tipos celulares. A expressão alterada de CDKN1B ou a sua deslocalização é frequentemente associada a um controlo desregulado do ciclo celular na biologia tumoral e a perturbações em contextos endócrinos e do desenvolvimento.

CDKN1B/Kip1 p27 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CDKN1B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CDKN1B/Kip1 p27 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CDKN1B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CDKN1B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CDKN1B/Kip1 p27. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CDKN1B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CDKN1B/Kip1 p27 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CDKN1B/Kip1 p27 em células tumorais com expressão de CDKN1B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.