CDKN1B/Kip1 p27 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400074-ACT

CDKN1B kodiert p27^Kip1, einen cyclinabhängigen Kinaseinhibitor, der das durch CDK2 bzw. CDK4/6 getriebene Fortschreiten durch den G1/S-Kontrollpunkt bremst, indem er Cyclin‑E/A–CDK2- und Cyclin‑D–CDK4/6‑Komplexe moduliert. p27 integriert mitogene und antiproliferative Signale nachgeschaltet an Signalwegen wie PI3K–AKT und TGF‑β, und seine Menge wird streng durch phosphorylierungsabhängige Ubiquitinierung und proteasomalen Abbau reguliert. Über diese Mechanismen beeinflusst CDKN1B Proliferations-, Ruhezustands- und Differenzierungsprogramme in vielfältigen Zelltypen. Eine veränderte CDKN1B-Expression oder Fehl-Lokalisierung wird in der Tumorbiologie häufig mit einer gestörten Zellzykluskontrolle in Verbindung gebracht und steht zudem mit Störungen in endokrinen und entwicklungsbiologischen Zusammenhängen in Zusammenhang.

CDKN1B/Kip1 p27 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CDKN1B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CDKN1B/Kip1 p27 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CDKN1B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CDKN1B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CDKN1B/Kip1 p27-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CDKN1B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CDKN1B/Kip1 p27-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CDKN1B/Kip1 p27-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CDKN1B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.