Cdc6 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400796-ACT

CDC6 codifica a ATPase humana Cdc6, um fator essencial de licenciamento da replicação do DNA que coopera com ORC e CDT1 para carregar a helicase MCM2–7 nas origens de replicação durante a fase G1. Ao coordenar o licenciamento das origens, a Cdc6 ajuda a assegurar que a replicação ocorra apenas uma vez por ciclo celular e se integra ao controlo da entrada em fase S, à sinalização de stress replicativo e às vias de checkpoint, incluindo ATR/CHK1. A expressão desregulada de CDC6 pode levar a disparos aberrantes de origens, instabilidade genómica e alterações na dinâmica do ciclo celular, características frequentemente observadas na biologia tumoral e noutras patologias associadas à proliferação. Como componente central da maquinaria de iniciação da replicação, CDC6 é frequentemente estudado no contexto de respostas a danos no DNA, stress replicativo induzido por oncogenes e mecanismos que acoplam o licenciamento da replicação ao estado da cromatina.

Cdc6 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CDC6 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Cdc6 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CDC6 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CDC6, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Cdc6. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CDC6 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Cdc6 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Cdc6 em células tumorais com expressão de CDC6 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.