Cdc25B Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401457-ACT

CDC25B codifica a Cdc25B, uma fosfatase de dupla especificidade que promove a progressão do ciclo celular ao desfosforilar sítios inibitórios em CDK1 e em outras quinases dependentes de ciclina relacionadas, facilitando a transição G2/M. Sua atividade é integrada à sinalização de checkpoints e a vias de resposta ao estresse, incluindo regulação por ATM/ATR–CHK1/CHK2 e modulação por proteínas 14-3-3, que influenciam a localização subcelular e o momento de entrada em mitose. Por coordenar checkpoints de dano ao DNA e o controle mitótico, a expressão e a desregulação de CDC25B são frequentemente examinadas em contextos de instabilidade genômica e proliferação aberrante. Como um nó em circuitos de quinases–fosfatases, a Cdc25B é amplamente estudada por suas contribuições ao controle do ciclo celular, à adaptação ao estresse replicativo e ao crosstalk entre vias relevante para a biologia do câncer.

Cdc25B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CDC25B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Cdc25B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CDC25B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CDC25B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Cdc25B. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CDC25B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Cdc25B no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Cdc25B em células tumorais com expressão de CDC25B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.