Plásmido CRISPR de Activación (h) Calpain 8: sc-402847-ACT

El CAPN8 humano codifica la calpaína 8, una proteasa de cisteína dependiente de calcio de la familia de las calpaínas que contribuye a la proteólisis regulada y al recambio de proteínas de manera dependiente del contexto. Al modular el corte de sustratos seleccionados, la calpaína 8 puede influir en la remodelación del citoesqueleto, el tráfico de membranas y los eventos de transducción de señales que configuran las respuestas celulares al estrés y los programas de diferenciación. El procesamiento mediado por calpaínas se entrecruza con redes de señalización por calcio y vías de proteostasis que coordinan la adaptación a señales ambientales. La actividad desregulada de las calpaínas se ha implicado en la patobiología inflamatoria y epitelial, lo que convierte a CAPN8 en una diana útil para estudios mecanísticos de la regulación dependiente de proteasas en células humanas.

Calpain 8 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CAPN8 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Calpain 8 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CAPN8 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CAPN8, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Calpain 8. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CAPN8 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Calpain 8 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Calpain 8 en células tumorales con expresión de CAPN8 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.