Calnexin CRISPR Activationプラスミド (h): sc-400154-ACT

ヒトCANXはカルネキシンをコードしており、カルネキシンは小胞体（ER）膜に存在するレクチン型シャペロンです。モノグルコシル化されたN結合型糖鎖を認識し、新生糖タンパク質の適切なフォールディングと品質管理を促進します。カルネキシンは、ERp57および糖タンパク質プロセシング酵素とともにカルネキシン／カルレティキュリン（calnexin/calreticulin）サイクルで機能し、ジスルフィド結合形成、ER内保持、ならびに誤折り畳み基質の小胞体関連分解（ERAD）を協調的に制御します。プロテオスタシスにおける中心的役割を介して、CANXはアンフォールドタンパク質応答（UPR）シグナル伝達、ERでのカルシウム恒常性、そして分泌経路フラックスの制御とも関連します。カルネキシン依存的なフォールディング能力の変化は、細胞ストレス表現型や、タンパク質の誤折り畳みおよび異常なトラフィッキングを伴う疾患関連メカニズムと関連づけられています。

Calnexin CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性CANXの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

Calnexin CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における CANX 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はCANX転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性Calnexinの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のCANX遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるCalnexin依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびCANX発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるCalnexin経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。