C-Nap1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403009-ACT

O CEP250 humano codifica a C-Nap1, uma proteína centrosomal do tipo coiled-coil concentrada nas extremidades proximais dos centríolos, onde ajuda a manter a coesão do centrossoma e organiza a ancoragem de microtúbulos. A C-Nap1 participa da separação dos centrossomas durante a progressão do ciclo celular por meio de remodelação dependente de fosforilação, apoiando a montagem correta do fuso, a segregação cromossômica e processos ligados à ciliogênese. A desorganização da integridade do centrossoma e da arquitetura dos microtúbulos é amplamente relevante para fenótipos de instabilidade cromossômica e tem sido associada a contextos de doenças do neurodesenvolvimento e da retina, nos quais a função de centrossomos e cílios é crítica. Por isso, o CEP250 é rotineiramente estudado em vias que regulam a dinâmica do centrossoma, a fidelidade mitótica e a organização do citoesqueleto.

C-Nap1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CEP250 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

C-Nap1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CEP250 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CEP250, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de C-Nap1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CEP250 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de C-Nap1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via C-Nap1 em células tumorais com expressão de CEP250 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.