BUBR1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403807-ACT

BUB1B codifica a BUBR1, um componente central do checkpoint de montagem do fuso, que protege a segregação cromossômica ao monitorar a ligação entre cinetócoro e microtúbulos e ao regular a atividade do APC/C por meio do complexo de checkpoint mitótico. A BUBR1 contribui para o tempo da mitose, a coesão entre cromátides-irmãs e a correção de erros, mantendo assim a estabilidade do genoma durante a divisão celular. A desregulação da função de BUB1B/BUBR1 está associada à instabilidade cromossômica e à aneuploidia, características frequentemente estudadas em biologia do câncer e em distúrbios do desenvolvimento que afetam o controle do ciclo celular. Como reguladora do checkpoint, a BUBR1 também é usada como um nó mecanístico para investigar respostas ao estresse mitótico e fenótipos dependentes de proliferação.

BUBR1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de BUB1B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

BUBR1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus BUB1B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição BUB1B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de BUBR1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus BUB1B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de BUBR1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via BUBR1 em células tumorais com expressão de BUB1B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.