beta-catenin Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-419477-ACT

Ctnnb1 codifica a beta-catenina, uma proteína multifuncional com repetições armadillo que conecta as junções aderentes baseadas em caderinas ao citoesqueleto de actina e atua como um coativador transcricional central na sinalização canônica de Wnt. Com a ativação da via Wnt, a beta-catenina estabilizada se acumula no núcleo e se associa a fatores TCF/LEF para regular programas gênicos que controlam proliferação, diferenciação, dinâmicas epitélio–mesenquimais e a manutenção de células-tronco. A regulação rigorosa da degradação/reciclagem da beta-catenina pelo complexo de destruição APC/AXIN/GSK3β é essencial para a homeostase tecidual, e a ruptura desse eixo está fortemente associada à sinalização oncogênica. Em modelos murinos, a perturbação de Ctnnb1 é amplamente utilizada para investigar desenvolvimento, regeneração e redes de sinalização relevantes para doenças no intestino, fígado, pele, osso e compartimentos imunes.

beta-catenin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Ctnnb1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

beta-catenin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Ctnnb1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Ctnnb1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de beta-catenin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Ctnnb1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de beta-catenin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via beta-catenin em células tumorais com expressão de Ctnnb1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.