beta Actin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h2): sc-400000-ACT-2

O ACTB humano codifica a beta-actina, uma proteína do citoesqueleto altamente conservada que polimeriza em microfilamentos para promover a manutenção da forma celular, a polaridade, a contratilidade e a motilidade. A dinâmica da beta-actina é central nas vias de remodelamento do citoesqueleto de actina que coordenam a renovação das adesões focais, a mecanotransdução, a citocinese e o tráfego vesicular, além de contribuir para a regulação transcricional por meio de processos nucleares dependentes de actina. A perturbação de ACTB ou de suas redes de interação está associada a distúrbios do desenvolvimento e a alterações na organização do citoesqueleto observadas na invasão e metástase de células cancerosas, ressaltando seu valor para o estudo de relações genótipo–fenótipo. Fluxos de trabalho de edição gênica direcionados a ACTB e de genômica funcional são comumente usados para investigar a sinalização regulada por actina, quantificar fenótipos do citoesqueleto em imagens de células vivas e estabelecer contextos de referência robustos para estudos de perturbação de vias.

beta Actin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ACTB sem alterar a sequência de ADN subjacente.

beta Actin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ACTB em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ACTB, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de beta Actin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ACTB nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de beta Actin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via beta Actin em células tumorais com expressão de ACTB silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.