Plasmide CRISPR d'Activation (h) ATGL: sc-401711-ACT

PNPLA2 code la lipase des triglycérides du tissu adipeux (ATGL), l’enzyme limitante de l’étape initiale d’hydrolyse des triacylglycérols stockés dans les gouttelettes lipidiques cytosoliques, générant des diacylglycérols et des acides gras libres destinés à la β‑oxydation mitochondriale et au maintien de l’équilibre énergétique cellulaire. L’activité d’ATGL intègre la dynamique des gouttelettes lipidiques aux réseaux de détection des nutriments et de signalisation métabolique, notamment aux programmes transcriptionnels pilotés par les PPAR et à la régulation de la lipolyse par des cofacteurs tels qu’ABHD5/CGI‑58 et des protéines inhibitrices comme G0S2. Une expression dérégulée de PNPLA2 ou une altération de la fonction d’ATGL perturbe le renouvellement des triglycérides et le flux d’acides gras, contribuant à des modifications du stockage lipidique, à un stress lipotoxique et à des phénotypes métaboliques observés dans le tissu adipeux, le foie, le cœur et le muscle squelettique. En tant que nœud central du catabolisme des lipides neutres, PNPLA2/ATGL est largement étudié dans des modèles de maladies de surcharge lipidique, de voies associées à la résistance à l’insuline et de réponses cellulaires à la privation de nutriments.

ATGL Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PNPLA2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ATGL Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PNPLA2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PNPLA2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ATGL. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PNPLA2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ATGL au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ATGL dans les cellules tumorales présentant une expression de PNPLA2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.