Atg9a Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-408011-ACT

ATG9A codifica a Atg9a, uma proteína de membrana conservada com múltiplos domínios transmembrana que fornece membrana ao fagóforo em expansão durante a macroautofagia e dá suporte à biogênese de autofagossomos. A Atg9a circula entre a rede trans-Golgi, endossomos e sítios de iniciação da autofagia, coordenando o tráfego de membranas com a maquinaria central de autofagia para manter a proteostase e o controle de qualidade de organelas. Por meio de suas funções no fluxo autofágico, a Atg9a influencia respostas ao estresse por privação de nutrientes, ao estresse do RE e a vias de autofagia seletiva que modulam a inflamação e o metabolismo celular. Alterações na regulação de ATG9A têm sido associadas à autofagia desregulada observada na biologia do câncer, em doenças neurodegenerativas e em interações hospedeiro–patógeno, tornando-a relevante para estudos mecanísticos de adaptação ao estresse associada a doenças.

Atg9a O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ATG9A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Atg9a O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ATG9A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ATG9A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Atg9a. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ATG9A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Atg9a no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Atg9a em células tumorais com expressão de ATG9A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.