Atg16 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404024-ACT

Das humane Gen **ATG16L1** kodiert **Atg16**, eine zentrale Komponente des **ATG12–ATG5–ATG16L1**-Komplexes, der die Autophagosomenbildung festlegt, indem er die **LC3-Lipidierung** an entstehenden Phagophoren steuert. Über seine Funktion in der Makroautophagie unterstützt Atg16 die zytoplasmatische Qualitätskontrolle, den Umsatz von Organellen und die zelluläre Anpassung an metabolischen Stress und greift zugleich in Signalwege der angeborenen Immunität sowie antimikrobielle Antworten ein. Eine veränderte ATG16L1-Aktivität wurde mit fehlregulierter Entzündung und einer gestörten Homöostase der epithelialen Barriere in Verbindung gebracht, und genetische Varianten in ATG16L1 sind mit einer erhöhten Anfälligkeit für entzündliche Darmerkrankungen assoziiert. Die Modulation der ATG16L1-Expression ist daher hilfreich, um den Autophagie-Flux, immunometabolische Wechselwirkungen und Stressantwort-Phänotypen in relevanten humanen Zellmodellen zu untersuchen.

Atg16 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ATG16L1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Atg16 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ATG16L1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ATG16L1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Atg16-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ATG16L1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Atg16-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Atg16-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ATG16L1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.