Atg16 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404024-ACT

L’ATG16L1 umano codifica Atg16, un componente essenziale del complesso ATG12–ATG5–ATG16L1 che determina la formazione dell’autofagosoma dirigendo la lipidazione di LC3 nei fagofori nascenti. Attraverso il suo ruolo nella macroautofagia, Atg16 contribuisce al controllo di qualità del citoplasma, al turnover degli organelli e all’adattamento cellulare allo stress metabolico, intersecandosi anche con la segnalazione dell’immunità innata e con le risposte antimicrobiche. Un’alterata attività di ATG16L1 è stata associata a infiammazione disregolata e a un’omeostasi compromessa della barriera epiteliale, e varianti genetiche in ATG16L1 sono collegate alla suscettibilità alle malattie infiammatorie intestinali. La modulazione dell’espressione di ATG16L1 è quindi utile per studiare il flusso autofagico, il crosstalk immunometabolico e i fenotipi di risposta allo stress in modelli cellulari umani pertinenti.

Atg16 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ATG16L1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Atg16 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ATG16L1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ATG16L1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Atg16. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ATG16L1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Atg16 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Atg16 nelle cellule tumorali con espressione di ATG16L1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.