Plasmide CRISPR d'Activation (h) ARV1: sc-407460-ACT

ARV1 (homologue d’ARV1) code une protéine membranaire multipasse, conservée au cours de l’évolution, localisée majoritairement dans le réticulum endoplasmique et impliquée dans l’homéostasie lipidique. Chez l’humain, ARV1 a été associée au transport des stérols et des sphingolipides, au maintien de la composition membranaire et à la coordination de processus dépendants du RE qui influencent la fonction de la voie sécrétoire et les réponses cellulaires au stress. Par son rôle dans l’organisation de l’équilibre lipidique et la dynamique des membranes, ARV1 peut affecter des réseaux de signalisation liés à l’intégrité des organites et à la protéostasie. Des perturbations de l’expression d’ARV1 ont été associées, dans des études génétiques, à des phénotypes neurodéveloppementaux et épileptiques, ce qui étaye sa pertinence pour la recherche sur les mécanismes de maladie dans des contextes métaboliques et neurologiques.

ARV1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ARV1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ARV1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ARV1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ARV1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ARV1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ARV1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ARV1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ARV1 dans les cellules tumorales présentant une expression de ARV1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.