APPL1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-428481-ACT

O gene murino Appl1 codifica a APPL1, uma proteína adaptadora endossomal que conecta a dinâmica de endossomos precoces positivos para Rab5 à transdução de sinais a jusante de receptores tirosina-quinase. A APPL1 participa da sinalização PI3K–AKT, de respostas à insulina e à adiponectina e da modulação de vias associadas a MAPK e NF-κB por meio de interações proteína–proteína que coordenam o tráfego intracelular com respostas transcricionais. Por essas funções, a APPL1 é amplamente relevante para estudos de homeostase metabólica, sensibilidade à insulina, inflamação e controle do crescimento celular. A desregulação da sinalização ligada à APPL1 e do roteamento endocítico tem sido implicada em modelos de doença metabólica e de sinalização proliferativa alterada, tornando o Appl1 um nó útil para a investigação de vias in vivo e em células cultivadas.

APPL1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Appl1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

APPL1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Appl1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Appl1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de APPL1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Appl1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de APPL1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via APPL1 em células tumorais com expressão de Appl1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.