APOBEC3A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-418267-ACT

A APOBEC3A humana codifica uma desaminase de citidina dependente de zinco da família APOBEC, que catalisa a edição de C para U em DNA de fita simples e pode influenciar a estabilidade do genoma durante o estresse de replicação. Ela participa da defesa antiviral inata e se relaciona com processos de resposta e reparo a danos no DNA, incluindo vias ligadas ao processamento da forquilha de replicação e à mutagênese. A atividade desregulada da APOBEC3A tem sido associada a assinaturas mutacionais características de desaminação de citidina observadas em diversos tipos de câncer e a contextos inflamatórios que aumentam substratos de DNA de fita simples. Como resultado, a APOBEC3A é amplamente estudada por seus papéis nas interações hospedeiro–patógeno, na restrição de retroelementos endógenos e nos mecanismos que moldam as paisagens de mutações somáticas.

APOBEC3A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de APOBEC3A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

APOBEC3A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus APOBEC3A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição APOBEC3A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de APOBEC3A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus APOBEC3A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de APOBEC3A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via APOBEC3A em células tumorais com expressão de APOBEC3A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.