AMPKγ3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403280-ACT

PRKAG3 codifica a subunidade reguladora AMPKγ3 da proteína quinase ativada por AMP (AMPK), um sensor central de energia que integra o estado AMP/ADP:ATP para coordenar a adaptação metabólica. Ao modular a ativação do complexo AMPK e o direcionamento a substratos, a AMPKγ3 influencia vias que controlam a captação de glicose, o metabolismo do glicogênio, a função mitocondrial e a homeostase lipídica por meio de nós a jusante como o mTORC1 e reguladores de autofagia. Embora seja mais bem caracterizada no músculo estriado, a sinalização alterada de AMPK envolvendo PRKAG3 é relevante para respostas ao estresse celular que se cruzam com a sensibilidade à insulina, a remodelação metabólica e a sinalização associada à inflamação. A atividade desregulada da via AMPK é frequentemente investigada em contextos como mecanismos de doenças metabólicas e estresse nutricional em células tumorais, nos quais a regulação dependente de PRKAG3 pode moldar fenótipos bioenergéticos.

AMPKγ3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PRKAG3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

AMPKγ3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PRKAG3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PRKAG3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de AMPKγ3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PRKAG3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de AMPKγ3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via AMPKγ3 em células tumorais com expressão de PRKAG3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.