Aldolase C Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400988-ACT

ALDOC codifica l’aldolasi C, un enzima glicolitico che catalizza la scissione reversibile del fruttosio-1,6-bisfosfato in gliceraldeide-3-fosfato e diidrossiacetone fosfato, collegando il metabolismo del glucosio alla produzione di ATP e ai flussi biosintetici. Nei tessuti umani, ALDOC è fortemente associato ai programmi metabolici neuronali e astrocitari e contribuisce ad accoppiare la glicolisi con l’equilibrio redox cellulare e le risposte allo stress. Un’alterata espressione di ALDOC è stata riportata in contesti di neurodegenerazione, danno ischemico e metabolismo tumorale, a supporto del suo impiego come marcatore e come nodo meccanicistico nel rimodellamento metabolico. In quanto componente centrale del metabolismo dei carboidrati, l’aldolasi C offre un punto di accesso per studiare il controllo della glicolisi, l’omeostasi energetica e il crosstalk metabolico con le vie mitocondriali.

Aldolase C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ALDOC senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Aldolase C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ALDOC nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ALDOC, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Aldolase C. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ALDOC nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Aldolase C nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Aldolase C nelle cellule tumorali con espressione di ALDOC silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.