AK4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-416951-ACT

O gene humano AK4 codifica a adenilato quinase 4, uma enzima da matriz mitocondrial que modula a homeostase de nucleotídeos de adenina ao catalisar reações de fosfotransferência que amortecem as razões ATP/ADP/AMP. Ao moldar o equilíbrio energético mitocondrial e a sinalização por nucleotídeos, a AK4 influencia a fosforilação oxidativa, o estado redox celular e programas adaptativos ao estresse associados à hipóxia e à remodelação metabólica. A alteração da expressão de AK4 tem sido associada a mudanças na proliferação, na sobrevivência sob estresse energético e a fenótipos de disfunção mitocondrial relevantes para a biologia do câncer e outros distúrbios em que a regulação bioenergética está comprometida. Como um nó metabólico mitocondrial, a AK4 é frequentemente estudada em vias que conectam o metabolismo de nucleotídeos, o manejo de espécies reativas de oxigênio e a sinalização mitocondrial associada à apoptose.

AK4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de AK4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

AK4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus AK4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição AK4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de AK4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus AK4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de AK4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via AK4 em células tumorais com expressão de AK4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.