ADH1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402260-ACT

O ADH1A humano codifica a álcool desidrogenase 1A (ADH1), uma oxidorredutase citosólica dependente de zinco que catalisa a oxidação do etanol e de outros álcoois de cadeia curta aos respetivos aldeídos, num processo dependente de NAD⁺. Esta atividade enzimática contribui para o metabolismo de xenobióticos e para a homeostase dos retinoides, ao influenciar a interconversão entre intermediários álcool e aldeído que se cruzam com reações de aldeído desidrogenases. A expressão de ADH1A é mais proeminente em contextos hepáticos e gastrointestinais, onde molda o equilíbrio redox celular (NADH/NAD⁺) e afeta o fluxo metabólico a jusante através de vias ligadas a aldeídos e ao acetil-CoA. A regulação alterada ou a variação genética em genes do metabolismo de álcool/aldeído, incluindo membros da família ADH, está associada a diferenças na suscetibilidade a lesão tecidual relacionada com o álcool e nas respostas à exposição a carcinogénios, tornando o ADH1A um nó útil para estudos de mecanismos de doença centrados no metabolismo.

ADH1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ADH1A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ADH1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ADH1A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ADH1A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ADH1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ADH1A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ADH1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ADH1 em células tumorais com expressão de ADH1A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.