Plasmide CRISPR d'Activation (h) A33: sc-404457-ACT

GPA33 code la glycoprotéine humaine A33, une molécule transmembranaire à passage unique présente à la surface cellulaire, impliquée dans la différenciation épithéliale et le maintien de l’adhésion intercellulaire. A33 est enrichie dans l’épithélium intestinal et est utilisée comme marqueur associé à une lignée dans les études portant sur l’identité des cellules gastro-intestinales, le trafic membranaire et la biologie de la barrière épithéliale. Ses profils d’expression et les altérations de sa régulation sont fréquemment évalués dans la recherche sur le cancer colorectal et d’autres maladies gastro-intestinales afin d’analyser les modifications des programmes épithéliaux associés aux tumeurs. GPA33/A33 constitue ainsi une cible aisément exploitable pour disséquer la biologie des antigènes de surface et les états de signalisation épithéliale dans des modèles cellulaires pertinents.

A33 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GPA33 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

A33 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GPA33 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GPA33, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de A33. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GPA33 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de A33 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie A33 dans les cellules tumorales présentant une expression de GPA33 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.