14-3-3 ε Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400998-ACT

YWHAE codifica a proteína adaptadora humana 14-3-3 épsilon (ε), um regulador que se liga a fosfoserina/fosfotreonina e modula a localização, a estabilidade e a atividade de diversas proteínas clientes. Por meio de interações com quinases e intermediários de sinalização, a 14-3-3 ε ajuda a coordenar as vias PI3K/AKT, MAPK e os checkpoints do ciclo celular, influenciando apoptose, proliferação e respostas ao estresse. Ela contribui para o remodelamento do citoesqueleto e para vias de desenvolvimento neuronal ao atuar como plataforma de complexos de fosfoproteínas e ajustar o tráfego subcelular. A desregulação da expressão de YWHAE ou alterações nas interações da 14-3-3 ε têm sido associadas a fenótipos do neurodesenvolvimento e a redes de sinalização oncogênicas, sustentando seu uso em estudos mecanísticos de reprogramação de sinalização.

14-3-3 ε O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de YWHAE sem alterar a sequência de ADN subjacente.

14-3-3 ε O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus YWHAE em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição YWHAE, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de 14-3-3 ε. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus YWHAE nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de 14-3-3 ε no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via 14-3-3 ε em células tumorais com expressão de YWHAE silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.