12-LO Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403010-ACT

ALOX12 codifica a 12-lipoxigenase (12-LO), uma dioxigenase de ferro não heme que converte o ácido araquidônico em ácido 12(S)-hidroperoxieicosatetraenoico e, a jusante, em mediadores lipídicos 12-HETE. Esses eicosanoides regulam a ativação plaquetária, a sinalização vascular e epitelial, as respostas ao estresse oxidativo e a remodelação de membranas, conectando a atividade de ALOX12 a vias inflamatórias e sensíveis ao estado redox. A sinalização da 12-LO cruza-se com programas de peroxidação lipídica e de modulação imune que influenciam a proliferação, a adesão e a migração celular. A expressão desregulada de ALOX12 ou o fluxo enzimático alterado têm sido associados a contextos cardiometabólicos e neuroinflamatórios, bem como à biologia do microambiente associado a tumores, o que motiva estudos mecanísticos de redes de mediadores lipídicos.

12-LO O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ALOX12 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

12-LO O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ALOX12 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ALOX12, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de 12-LO. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ALOX12 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de 12-LO no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via 12-LO em células tumorais com expressão de ALOX12 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.