Plasmide CRISPR d'Activation (h) α-tectorin: sc-405876-ACT

TECTA code l’α‑tectorine, une glycoprotéine majeure non collagénique de la membrane tectoriale de l’oreille interne, qui contribue à organiser l’architecture de la matrice extracellulaire nécessaire à une mécano‑transduction électrophysiologique efficace par les cellules ciliées cochléaires. Par ses rôles dans l’assemblage de la matrice et le couplage structurel entre la membrane tectoriale et les stéréocils, l’α‑tectorine soutient les forces de cisaillement induites par le son et l’accord en fréquence. Une altération de TECTA peut perturber l’intégrité de la membrane tectoriale et modifier la fonction auditive, ce qui en fait un gène clé pour l’étude de la biologie de la matrice extracellulaire sensorielle. Les variations de TECTA sont associées à des formes héréditaires de déficience auditive, reliant la fonction de l’α‑tectorine à des phénotypes pertinents pour la maladie dans les modèles de recherche en audition.

α-tectorin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TECTA sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

α-tectorin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TECTA dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TECTA, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de α-tectorin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TECTA natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de α-tectorin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie α-tectorin dans les cellules tumorales présentant une expression de TECTA silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.