WSTF Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404237-ACT

O BAZ1B humano codifica o fator de transcrição da síndrome de Williams (WSTF), uma proteína nuclear associada à cromatina que integra o remodelamento dependente de ATP com a fosforilação da histona H2A.X durante as respostas a danos no DNA. O WSTF atua no complexo WICH com a SMARCA5 e também contribui para o remodelamento de cromatina da família ISWI, conectando o posicionamento de nucleossomos à regulação transcricional e à manutenção da cromatina associada à replicação. Por meio dessas atividades, o BAZ1B influencia a estabilidade do genoma, a progressão do ciclo celular e programas de expressão gênica dependentes da RNA polimerase II. Alterações na dosagem de BAZ1B e estados de cromatina desregulados dependentes de WSTF têm sido associados a fenótipos do neurodesenvolvimento e a perturbações transcricionais mais amplas relevantes para a biologia das doenças.

WSTF O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de BAZ1B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

WSTF O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus BAZ1B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição BAZ1B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de WSTF. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus BAZ1B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de WSTF no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via WSTF em células tumorais com expressão de BAZ1B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.