Ubr1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403943-ACT

O UBR1 humano codifica a ligase E3 de ubiquitina Ubr1, um componente-chave de reconhecimento da via da regra do N-terminal (N-end rule), que conecta degrons N-terminais à degradação proteassomal dependente de ubiquitina. Ao controlar a estabilidade de proteínas mal dobradas, danificadas ou regulatórias, a Ubr1 contribui para o controle de qualidade de proteínas no citosol, a adaptação ao estresse e redes mais amplas de proteostase que se cruzam com o sistema ubiquitina–proteassoma. A atividade de UBR1 influencia a homeostase celular por meio da degradação regulada de substratos, impactando a dinâmica de sinalização e respostas metabólicas. A perturbação genética de UBR1 está associada a fenótipos de doenças hereditárias, sustentando sua relevância para o estudo de mecanismos de falha de proteostase e de relações genótipo–fenótipo em células humanas.

Ubr1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de UBR1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Ubr1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus UBR1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição UBR1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Ubr1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus UBR1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Ubr1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Ubr1 em células tumorais com expressão de UBR1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.