Trp7 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-408046-ACT

TRPM2 (nota anche come Trp7) codifica un canale cationico non selettivo, permeabile al Ca2+, appartenente alla famiglia dei TRP, attivato dall’ADP-ribosio e regolato dallo stress ossidativo intracellulare. L’ingresso di Ca2+ mediato da TRPM2 collega i segnali redox a processi a valle che includono la funzione mitocondriale, la produzione di citochine e chemochine, le risposte associate all’inflammasoma e programmi di morte cellulare come apoptosi e necroptosi. Il canale integra input provenienti dal metabolismo del NAD+ e dalla segnalazione dipendente da PARP, contribuendo a modellare l’omeostasi del calcio e le risposte trascrizionali adattative allo stress. Un’attività deregolata di TRPM2 è stata implicata in meccanismi infiammatori e neurodegenerativi, nella biologia del danno da ischemia-riperfusione e nella segnalazione del microambiente associato ai tumori, a supporto della sua rilevanza in modelli di dissezione delle vie di segnalazione.

Trp7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TRPM2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Trp7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TRPM2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TRPM2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Trp7. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TRPM2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Trp7 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Trp7 nelle cellule tumorali con espressione di TRPM2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.