TRADD Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401177-ACT

O TRADD humano (TNFRSF1A-associated via death domain) é uma proteína adaptadora que acopla o receptor de TNF 1 ativado a complexos de sinalização a jusante que controlam a transcrição inflamatória e as decisões de destino celular. Por meio de interações do seu domínio de morte, o TRADD participa da montagem de complexos proximais ao receptor que regulam as vias canônicas de NF-κB e MAPK, e também pode influenciar a sinalização apoptótica dependente de caspases, dependendo do contexto celular. A sinalização mediada por TRADD molda respostas imunes inatas, a produção de citocinas e respostas ao estresse, tornando-o relevante para estudos de inflamação crônica, desregulação imune e mecanismos de sobrevivência de células tumorais. Alterações na atividade do eixo TNF/TRADD têm sido implicadas em diversos fenótipos associados a doenças, nos quais a transcrição dirigida por NF-κB e a sinalização por receptores de morte estão perturbadas.

TRADD O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TRADD sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TRADD O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TRADD em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TRADD, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TRADD. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TRADD nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TRADD no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TRADD em células tumorais com expressão de TRADD silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.